免疫组化常见问题和解决方法一

免疫组化常见问题和解决方法一

1、染色过强 原因 解决办法 抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长 降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间：室温1 小时或4℃过夜 孵育温度过高，孵育温度超过37℃ 一般室温20-28℃ DAB 显色时间过长或 DAB 浓度过高 显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准 2、非特异性背景染色 原因 解决办法 操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3×5 组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长 组织中含内源性生物素 正常非免疫动物血清再封闭 血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间 3、染色弱 原因 解决办法 抗体浓度过低，孵育时间过短 提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟 试剂超过有效使用期 及时更换试剂 操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致 使试剂稀释 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥） 室温太低，低于15℃ 若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟（或4℃冰 箱过夜） 蛋白封闭过度 封闭时间不要超过10分钟 4、染色阴性 原因 解决办法 操作步骤错误 重新试验，设立阳性对照 组织中无抗原 设立阳性对照片，以验证实验结果 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗与二抗种属无误