免疫组化染色关键步骤分析

免疫组化染色关键步骤分析

免疫组化染色

1. 石蜡切片，步骤同前。切片经贴片后，60℃烤片30min使蜡熔化，经二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10min,脱蜡。然后，将切片放入100%、95%、90%、80%、70%乙醇中3-5min，再放入蒸馏水中3min，水化。

2．脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4，具体看所用抗体及染色试剂说明)冲洗3次，每次3分钟。洗瓶冲洗。

3. 根据抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。可选步骤，具体见抗体说明书。

4.每张切片加1滴或50μl 3%过氧化氢，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3分钟。此步骤是对内源性过氧化物酶含量高的组织而言。

4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl的第一抗体，室温下孵育60分钟或4℃过夜，具体参见每种抗体的说明书。PBS冲洗3次，每次3分钟。

5. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl 即用型MaxVisionTM 试剂或SP试剂（采用武汉艾迪抗效果更佳），室温下孵育10-15分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。

6. 除去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3-5分钟（DAB）或37℃环境下10-30分钟(AEC)。

7. 自来水冲洗，苏木素复染10分钟，PBS或自来水冲洗返蓝。如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，步骤同H-E染色，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。